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小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)ELISA試劑盒使用說明書




www.qaimwd.tw
EK-Bioscience
Biotechnology Co., Ltd. Shanghai enzyme research
This kit is for in vitro research use, not for clinical diagnosis!
(本試劑盒僅供體外研究使用,不用于臨床診斷!)

  小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)酶聯免疫分析試劑盒
         Mouse(D-LDH)ELISA Kit
          CAS.NO:Ek-M20042
聲明:尊敬的客戶,感謝您選用本公司的產品。本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關液體樣本中D 乳酸脫氫酶(D-LDH)含量。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分!如有疑問,請及時聯系我們。

實驗原理
   本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)水平。用純化的小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入D 乳酸脫氫酶(D-LDH),再與HRP 標記的D 乳酸脫氫酶(D-LDH)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的D 乳酸脫氫酶(D-LDH)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),通過標準曲線計算樣品中小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)濃度。
試劑盒組成:

中文名稱English name 96T/48T 含量保存
ELISA 酶標板(可拆卸) Microelisa stripplate 8×12 / 8×6 * 2-8℃
標準品(120ng/L) Standard 1 瓶0.5ml * 2-8℃
標準品稀釋液Standard diluent 1 瓶1.5ml * 2-8℃
酶標試劑HRP-Conjugate reagent 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
樣品稀釋液Sample diluent 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
顯色劑A 液Chromogen Solution A 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
顯色劑B 液Chromogen Solution B 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
終止液Stop Solution 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
濃縮洗滌液wash solution 1 瓶20ml * 2-8℃
說明書Instruction 1 份*
封板膜Closure plate membrane 2 片*
密封袋Sealed bags 1 個*

標本要求
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20 分鐘后,離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合10-20 分鐘后,離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成應再次離心。
3. 尿液:用無菌管收集。離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。
5. 培養細胞:檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml 左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
6. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
7. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融
8.不能檢測含NaN3 的樣品,因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

試驗所需自備物品:
1. 酶標儀(450nm 波長濾光片)
2. 高精度移液器,EP 管及一次性吸頭
3. 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙
操作步驟
1. 標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
60ng/L 5 號標準品150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
30ng/L 4 號標準品150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
15ng/L 3 號標準品150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
7.5.ng/L 2 號標準品150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
3.75ng/L 1 號標準品150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液:將30 倍(48T 的20 倍)濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此重復5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
7. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
8. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此重復5 次,拍干。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
10 分鐘.
10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
11. 測定:以空白空調零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。測定應在加終止液后15 分鐘以內進行。

計算
   以標準物的濃度為橫坐標,OD 值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD 值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。

注意事項
1.試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
3.各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5 分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線,最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD 值大于標準品孔第一孔的OD 值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n 倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(×n×5)。
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。
實驗目的、靈敏度、檢測范圍和重復性:
●實驗目的:測定小鼠血清、血漿及相關液體樣本中D 乳酸脫氫酶(D-LDH)含量。
●靈敏度:最小可測0.9ng/L。
●檢測范圍1.5ng/L - 70ng/L。
●重復性:板內,板間變異系數均<10%。
問題分析
若實驗效果不好,請及時對顯色結果拍照,保留所用板條及未使用試劑,并妥善保存,然后聯系我公司技術支持為您解決問題。同時您也可以參考以下資料:
問題描述可能原因相應對策
標準曲線梯
度差
吸液或加液不準檢查移液器及吸頭
標準品稀釋不正確溶解標準品稍微旋轉瓶身,輕輕混勻使粉末完全溶解
洗滌不完全保證洗滌時間和洗滌次數及每孔的加液量
顯色很弱或
無色
孵育時間太短保證充足的孵育時間
實驗溫度不正確使用推薦的實驗溫度
試劑體積不夠或漏加檢查吸液及加液過程,保證所有試劑按順序足量添加
稀釋不正確
讀數數值低酶標儀設置不正確在酶標儀上檢查波長及濾光片設置
提前打開酶標儀預熱
變異系數大加液不正確檢查加液情況
背景值高
檢測抗體的工作濃度使用推薦的稀釋倍數
酶標板洗滌不完全重新閱讀操作手冊,保證清洗完全;如果用自動洗板
機,請檢查所有的出口是否有堵塞
洗液有污染配制新鮮的洗液
靈敏度低ELISA 試劑盒保存按說明書要求保存相關試劑
讀數前未終止OD 讀數前應在每孔中加入終止液
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